Créé en 1923, le Laboratoire constitue aujourd’hui un trait d’union significatif entre la tradition vaticane et les méthodologies expérimentales modernes. Il plonge ses racines historiques dans la tradition séculaire d’entretien des collections vaticanes, comme en témoigne l’institution depuis 1543, avec le Bureau du Mundator créé par le pape Paul III. C’est un disciple de Michel-Ange Buonarroti, Francesco Amadori dit l’Urbino, qui fut le premier à devoir s’occuper du dépoussiérage de la Chapelle Sixtine. La sensibilité croissante pour la conservation et la protection du patrimoine artistique, surtout pictural, est attestée par les nombreuses dispositions en la matière qui se sont succédées dans le temps : depuis les Lettres apostoliques de Benoît XIV de 1757, qui contiennent des normes pour la sauvegarde des œuvres d’art, au premier Règlement des Musées et des Galeries pontificales de 1816, jusqu’à l’Édit Pacca de 1820, qui met en place sur le plan légal une action plus forte dans la « […] restauration et conservation des Monuments publics d’Antiquité et d’Art […] ». Puis, ce sera Léon XII (1823-1829) qui destinera quelques pièces situées sous la Bibliothèque vaticane à devenir des dépôts des Musées et un atelier de restauration.

Un siècle plus tard, on arrive à la création du « Laboratoire de restauration des peintures ». Sa fondation en 1923 est un tournant parce qu’on voit s’affirmer une conscience solide en matière de conservation aux Musées du Vatican. Au point que l’architecte de la nouvelle Pinacothèque, Luca Beltrami, décide de placer les locaux des Laboratoires en dessous de la Pinacothèque en les dotant d’un monte-charges capable de renfermer le plus grand tableau de la collection, La Communion de saint Jérôme du Dominiquin. L’objectif premier est de permettre le transport des œuvres dans des conditions de sécurité maximale.
Au fil des ans, les activités du Laboratoire ont touché un patrimoine très vaste et difficile à quantifier tellement il est étendu sur le territoire : depuis l’État de la Cité du Vatican aux principales Basiliques romaines, pour arriver aux Villas pontificales de Castel Gandolfo, et en particulier le Palais apostolique.