Fondato nel 1923, il Laboratorio rappresenta oggi un punto di unione significativo tra la tradizione vaticana e le metodologie sperimentali moderne. Esso affonda le sue radici storiche nella plurisecolare tradizione manutentiva delle raccolte vaticane, come testimonia l’istituzione nel lontano 1543 dell’Ufficio del Mundator da parte di papa Paolo III. È un discepolo di Michelangelo Buonarroti, Francesco Amadori detto l’Urbino, ad essere incaricato per primo della periodica spolveratura della Cappella Sistina. La crescente sensibilità per la conservazione e tutela del patrimonio artistico, soprattutto pittorico, è testimoniata dalle numerose disposizioni in materia che si sono succedute nel tempo: dalle Lettere Apostoliche di Benedetto XIV del 1757, contenenti norme per la salvaguardia delle opere d’arte, al primo Regolamento dei Musei e delle Gallerie Pontificie del 1816, fino all’Editto Pacca del 1820, che istituisce a livello legislativo una maggiore azione nella “[…] ristaurazione e conservazione dei pubblici Monumenti di Antichità e d’Arte […]”. Sarà, quindi, Leone XII (1823-1829) a destinare alcuni locali situati sotto gli ambienti della Biblioteca Vaticana ad uso di magazzini dei Musei e di Officina di restauro.

Con un salto di quasi un secolo si arriva alla fondazione dell’allora “Laboratorio di Restauro Pitture”. La sua istituzionalizzazione nel 1923 segna un momento importante per l’affermazione di una salda coscienza conservativa presso i Musei Vaticani. Tanto che il progettista della nuova Pinacoteca, l’architetto Luca Beltrami, decide di ubicare i locali dei Laboratori al di sotto della stessa Pinacoteca, dotandoli di un montacarichi in grado di contenere il quadro più grande della collezione: “La comunione di San Girolamo” del Domenichino. L’obiettivo principale è quello di consentire il rapido trasferimento delle opere in condizioni di massima sicurezza.
Negli anni, le attività del Laboratorio hanno interessato un patrimonio vasto e difficilmente quantificabile, oltre che piuttosto esteso sul territorio: dallo Stato della Città del Vaticano alle principali Basiliche romane, per arrivare alle Ville Pontificie di Castel Gandolfo, in particolare il Palazzo Apostolico.